Monitoreo molecular y armonización de la RT-qPCR

¿POR QUÉ LA NECESIDAD DEL MONITOREO MOLECULAR EN EL TRATAMIENTO DE LA LMC?
La introducción de los TKIs (terapia dirigida al blanco molecular) permitió que la mayoría de los pacientes LMC en fase crónica de diagnóstico reciente, alcanzara una repuesta citogenética completa (RCC) al cabo de un año de tratamiento. Pero, aún con RCC, la médula ósea todavía contiene un número muy elevado de células leucémicas (alrededor de 106 células); ésto sugiere que la normalización citogenética (RCC) obedece a la baja sensibilidad del método, y, a la vez, que es necesario usar métodos más sensibles de monitoreo. Así, fue necesario implementar la PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR), para medir, con una sensibilidad superior (hasta 100.000 veces más), los niveles de transcripto quimérico BCR-ABL1 en leucocitos de sangre periférica de pacientes en RCC. Según la profundidad de la respuesta molecular alcanzada, y el tiempo necesario para lograrla, pudieron establecerse “criterios temporales de respuesta molecular” con significado pronóstico. El más significativo fue la definición de respuesta molecular mayor (RMM; <0,1% de transcriptos BCR-ABL1) que representa
uno de los principales objetivos terapéuticos. A partir de este estudio también fueron definidos los criterios moleculares de respuesta óptima, las “advertencias” (warnings) en pacientes que no alcanzan la respuesta ideal, y las fallas. Las definiciones de “falla”, “warning/ advertencia” y “respuesta óptima” tienen en cuenta la profundidad de la respuesta molecular y el tiempo necesario para obtenerla. Para una correcta evaluación de la respuesta molecular se requiere que los laboratorios utilicen metodologías armonizadas a una escala única de referencia (la escala internacional, IS).   Tanto la guía Americana (NCCN, National Comprehensive Cancer Network), como la Europea (ELN, European Leukemia Net), consideran al monitoreo molecular por RT-qPCR la mejor opción para evaluar respuesta y evolución del paciente, y destacan que estos estudios deben ser efectuados en laboratorios que utilizan la escala internacional (IS).
¿CÓMO Y POR QUÉ SURGE LA ESCALA INTERNACIONAL (IS)?
La RT-qPCR es un proceso complejo en el que intervienen muchos factores (conservación de las muestras, extracción de RNA, copia de RNA a cDNA, eficiencia de la qPCR, plataforma utilizada, el gen control empleado). En consecuencia, los resultados pueden ser muy variables, comprometiendo su potencial significado clínico. La IS representa un método práctico que permite comparar los resultados de RT-qPCR obtenidos en diferentes centros; consecuentemente, los médicos de cualquier parte del mundo, pueden adoptar las guías internacionales de tratamiento para pacientes con LMC.
La IS se establece en el año 2005, a partir de un encuentro de expertos en el NIH (National Institute of Health, Bethesda, USA); y es tomada como referencia internacional para informar los resultados de RT-qPCR. En el mismo encuentro se estableció que, para adoptar la IS, cada laboratorio debía determinar un “factor de conversión” (FC) para hacer sus resultados comparables con los de los laboratorios “patrón”. Este factor de conversión debe ser actualizado al menos una vez por año, o cuando se produzca algún
cambio significativo en la metodología empleada.
 
Ventajas de este proceso: todos hablamos el mismo “idioma” en términos de respuesta molecular; así, la RMM expresa una reducción de 3 logaritmos en la masa tumoral inicial, y la RM4.5 indica una disminución de 4.5 logaritmos.

Desventajas:
la actualización anual del factor de conversión es cara y engorrosa (intercambio de muestras y comparación de resultados).

Para simplificar y hacer más accesible el proceso de obtención del FC, en el 2009 la OMS aprobó el “Primer panel genético de referencia –OMS- para cuantificación de BCR-ABL mRNA” (The first World Health Organization International Genetic Reference Panel for quantitation of BCR-ABL mRNA), material de referencia universal disponible como “Calibradores primarios de la OMS” para laboratorios especializados con capacidad de producir “calibradores secundarios” a partir de los primarios; de esta manera, se simplifica el proceso de “universalizar” la obtención del factor de conversión, que puede extenderse a más laboratorios.
¿PARA QUÉ SIRVE EL MONITOREO MOLECULAR DE LA LMC?
Se recomienda realizar el monitoreo molecular en forma regular durante el tratamiento; sin embargo hay algunas diferencias con respecto a la frecuencia sugerida, dependiendo de la guía consultada:
— La NCCN recomienda hacerlo al diagnóstico y luego cada 3 meses (o cada 6 una vez alcanzada la RCC) durante 3 años.
— La ELN recomienda hacerlo cada 3 meses hasta alcanzar la respuesta molecular mayor y luego al menos cada 6 meses.

Cualquiera sea la guía que se siga, es importante tener en cuenta que un monitoreo molecular frecuente posibilita al médico:
1. Determinar el nivel de respuesta alcanzado;
2. Identificar tempranamente pacientes con menor probabilidad de alcanzar una respuesta óptima;
3. Detectar tempranamente aumentos en los niveles de Bcr-Abl1, posibilitando rápidamente la toma de decisiones; (un incremento en el número de transcriptos puede anunciar una pérdida de respuesta, sea por adquisición de una mutación, mala adherencia, u otros mecanismos de resistencia);
4. Poner en evidencia la persistencia de bajos niveles de transcriptos de Bcr-abl1 (enfermedad residual mínima) a partir de los que, de discontinuar el tratamiento, el paciente podría perder respuesta y recaer.

La cantidad y calidad de RNA total tendrá impacto en la sensibilidad del ensayo, afectando el resultado final de la medición de respuesta molecular, pudiendo incidir en la toma de decisión del médico tratante. Para reducir el efecto de estas variables se usa un gen control que permite compensar todas estas variables y por lo tanto hacer el ensayo más reproducible y confiable. El gen control asegura que las muestras de RNA y DNA de los pacientes sean siempre de la misma calidad y cantidad. Los tres genes control más empleados son BCR (utilizado en el estudio IRIS), ABL1 y GUSB (utilizados por el consorcio europeo).
¿CUÁL ES EL LÍMITE DEL MONITOREO MOLECULAR?
Los TKIs disponibles ofrecen al paciente la posibilidad de alcanzar respuestas moleculares profundas y sostenidas y, eventualmente, formar parte de protocolos de discontinuación. En algunos casos, la respuesta molecular es tan intensa que no es posible detectar transcriptos ni siquiera con una técnica de tanta sensibilidad como la RT-qPCR; sin embargo, no es posible asumir que el clon leucémico haya desaparecido, sino que la cantidad remanente de células tumorales está por debajo del nivel de sensibilidad del método (enfermedad residual). Por ello, el término respuesta molecular completa (RMC) ha sido remplazado por respuesta molecular (RM), al que se agrega el nivel de sensibilidad alcanzado. La sensibilidad del ensayo es variable de centro a centro, y también dentro el mismo centro, de muestra a muestra.

Así, definimos una RM4.0 (0,01%IS, 4 Logs de reducción), RM4.5 (0,0032% IS, 4,5 Logs de reducción) y RM5.0 (0,001% IS, 5 Logs de reducción), y la RMM (respuesta molecular mayor), basada en el límite de 0,1% IS (3 Logs de reducción con respecto al valor base del IRIS, RM3.0) En el caso de las muestras “negativas”, el número de copias del gen control marca la sensibilidad con la cual podemos descartar la presencia de BCR-ABL1; RM4.0 cuando ABL>10.000 copias, RM4.5 cuando ABL>32.000 copias, y RM5.0 cuando ABL>100.000 copias (ver Tabla 1).

 

A partir de los resultados de los últimos protocolos de discontinuación, es evidente que entre los factores pronósticos asociado al éxito de
discontinuar el tratamiento en forma segura, están el tiempo necesario para alcanzar la negatividad del BCR-ABL1, es decir, indetectable con RM > 4.0 (Respuesta Molecular Profunda), y la duración y persistencia de la respuesta molecular profunda (indetectable con RM > 4.0 en varios estudios seriados).

 

Tabla 1: Valores de referencia de la escala internacional y definición de la respuesta molecular.
 
Tabla cuadro
CITAS